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摘要：目的：研究唑來膦酸（Zoledronateacid）和異戊烯焦磷酸（IPP）體外擴增前列腺癌患者外周血中γδT細胞的效率。方法：密度梯度離心法分離外周血中單個核細胞（PBMCs），分別加入5．0μmol／LZol或10．0μg／mlIPP聯(lián)合1000IU／ml的rhIL－2于含10％自體血漿的AIM－V培養(yǎng)體系培養(yǎng)，觀察并收集細胞，采用流式細胞儀檢測刺激后CD3＋Vγ9＋的γδT細胞數(shù)量和比例，并計算其擴增效率。結果：經(jīng)14天擴增培養(yǎng)后，兩種磷酸抗原均能在體外擴增前列腺癌患者外周血中的γδT細胞，Zol組的γδT細胞在淋巴細胞中最高含量達64．7％，IPP組最高達55．9％，且擴增培養(yǎng)至第9天的γδT細胞對腫瘤細胞有一定的殺傷活性，但Zol組的擴增效率以及細胞的殺傷活性均明顯強于IPP組（P＜0．05）。結論：Zol具有與IPP體外擴增外周血中γδT細胞的能力，Zol刺激法可能成為體外擴增前列腺癌患者外周血中γδT細胞更為經(jīng)濟安全的選擇。

關鍵詞：前列腺癌；γδT細胞；唑來膦酸；異戊烯焦磷酸

γδT細胞是其T細胞受體（Tcellreceptor，TCR）由γ鏈和δ鏈構成的一類具有獨特生物學特征的T淋巴細胞亞群［1，2］，它能迅速識別外源性病原體和內(nèi)源性應激誘導的配體并啟動適應性免疫應答，故γδT細胞被視為人體免疫防御和免疫監(jiān)視的第一道重要防線［3］。γδT細胞兼具T輔助細胞（Th）和細胞毒T細胞的雙重細胞效應，當其發(fā)揮作用后，可通過自身抗原遞呈細胞（APC）樣效應或通過所分泌的細胞因子效應進一步誘導或促進特異性T細胞應答［4－6］。因而γδT細胞被認為可能是介于獲得性免疫與天然免疫之間的特殊免疫細胞類型，具有抗原特異性識別功能而無MHC限制，并在機體抗感染和自身免疫疾病及抗腫瘤等過程中起重要作用［3，7］。但γδT細胞在人外周血中的含量僅0．5％～10％左右，因此如何有效擴增腫瘤患者外周血中γδT細胞是其應用于臨床治療的先決條件。磷酸抗原體外特異性擴增健康人外周血中的γδT細胞能力已經(jīng)得到反復證實，其中報道比較多的是異戊烯焦磷酸（IPP）對γδT細胞的擴增方法［8，9］，IPP體外刺激擴增效率的確有效，但其價格較昂貴，且對細胞毒性較大，不利于臨床推廣應用，近期有文獻報道將骨質(zhì)疏松的治療藥物唑來磷酸（Zoledronateacid，Zol）用于體外擴增γδT細胞也取得了良好的效果［10，11］。為了建立一種經(jīng)濟有效、安全簡便體外擴增γδT細胞的方法，本實驗對比研究兩種磷酸抗原Zol和IPP在體外對前列腺癌患者外周血中的γδT細胞特異性的擴增能力和方法。

1材料與方法

1．1標本來源本試驗所采用前列腺癌患者外周血來自深圳市人民醫(yī)院。

1．2主要儀器與試劑AIM－VCTSTM培養(yǎng)基購自Gibco公司（GrandIsland，NY，USA），重組人白細胞介素2（rhIL－2）購自雙鷺藥業(yè)；淋巴細胞分離液購自NycomedPharma公司（NycomedPharmaAS，Oslo，Norway），唑來磷酸注射液購自諾華公司，IPP購自Sigma公司，F(xiàn)ITC標記的抗Vγ9（Vγ9－FITC）、PE標記的CD4（CD4－PE）、PerCP標記的CD3（CD3－PerCP）、APC－H7標記的CD8（CD8－APC－H7）單克隆抗體均購自BD／Pharmingen公司，流式細胞分析儀為FACSCantoⅡ（美國BD），分析軟件為BDCellQuest。

1．3方法

1．3．1細胞培養(yǎng)抽取前列腺癌患者的靜脈外周血至含有肝素鈉的離心管中，離心獲得血清和全血細胞，將全血細胞經(jīng)密度梯度離心獲得單個核細胞（PBMC）。收集的PBMC重懸于含10％自體滅活血漿的AIM－VCTSTM培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度（1～2）×106／ml左右，加入不同濃度的Zol和IPP，每組3個重復，并加入rhIL－2至終濃度1000IU／ml，最后轉移入培養(yǎng)瓶內(nèi)于37℃，5％CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。1．3．2γδT細胞表型分析取加不同濃度的磷酸抗原因子誘導的γδT細胞，1000r／min離心5min后用1×PBS洗1次，在1500r／min下離心5min，調(diào)整細胞數(shù)大約（5～10）×105每管每100μl，加Vγ9－FITC，CD4－PE，CD3－PerCP，CD8－APC－H7各2μl，吹勻，避光孵育20min，PBS洗1次，最后以PBS400μl重懸，上機檢測。檢測磷酸抗原誘導前后γδT細胞的比例，流式細胞儀檢測結果使用BDCellQuest軟件進行分析。

1．3．3γδT細胞殺傷活性檢測以CellCountingKit－8測定γδT細胞殺傷活性，以前列腺癌DU145細胞作為靶細胞，按效靶細胞比5∶1、10∶1、20∶1的比例加入培養(yǎng)至第9天的γδT細胞，37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中過夜，加入20μl／孔的CCK－8在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h，用酶標儀測定在450nm處的吸光度（A）值。殺傷率（％）＝1－［（實驗組OD值－單獨的效應細胞組OD值）］／單獨的靶細胞組OD值×100％。

1．4統(tǒng)計學處理統(tǒng)計學處理用GraphPadPrism6統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以珋x±s表示，組間比較采用t－test，檢驗分析P＜0．05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2．1Zol／IPP刺激γδT細胞的增殖效率比較經(jīng)磷酸抗原聯(lián)合rhIL－2刺激前列腺癌患者外周血PBMCs第三天開始可見細胞成集落生長，與IPP相比，經(jīng)Zol刺激擴增γδT細胞生長狀態(tài)較好，且集落多，大（圖1）。細胞培養(yǎng)至第5天開始γδT細胞增殖成對數(shù)生長，利用不同磷酸抗原刺激γδT細胞擴增培養(yǎng)至14天后，用流式細胞術測定其γδT細胞的增殖情況（圖2），結果顯示在培養(yǎng)的前五天，二者刺激擴增的γδT細胞增殖效果相當，但在培養(yǎng)至第5天后，Zol刺激γδT細胞的增殖效率明顯高于IPP組，且在第九天時γδT細胞含量最高，Zol組最高達64．7％，IPP組最高達55．9％（P＜0．05）。

2．2Zol／IPP刺激γδT細胞的殺傷活性比較以前列腺癌Du145細胞作為靶細胞，取培養(yǎng)至第9天的γδT細胞為效應細胞，按效靶比為5∶1，10∶1，20∶1混合，比較Zol和IPP刺激培養(yǎng)的γδT細胞對前列腺癌Du145細胞株殺傷活性（圖3）。如圖所示，在同一效靶比下，Zol組刺激擴增得到的γδT細胞對前列腺癌細胞的殺傷能力明顯強于IPP組，在效靶比20∶1下，Zol組γδT細胞對前列腺癌細胞的殺傷率達到45．9％，IPP組γδT細胞對前列腺癌細胞的殺傷率為33．5％（P＜0．05）。圖3Zol／IPP刺激擴增的γδT細胞對DU145細胞毒活性檢測（P＜0．05）Fig．3CytotoxiceffectsofγδTcellsstimulatedbyZol／IPPtoDU145tumorcells（P＜0．05）

2．3Zol／IPP對γδT細胞增殖效應的動態(tài)觀察為了更充分地了解Zol／IPP擴增γδT細胞的動態(tài)進程，從第5天開始到第14天，每2天收集培養(yǎng)的細胞，測定其增殖情況并計算增殖倍數(shù)（圖4）。如圖所示，Zol／IPP聯(lián)合rhIL－2增殖倍數(shù)的峰值均出現(xiàn)在第11天，在培養(yǎng)的前9天中，對于兩種不同磷酸化合物而言，IPP的刺激效應相對緩慢些，增殖倍數(shù)無統(tǒng)計學差異（P＞0．05），但在第9天后，Zol刺激的γδT細胞增殖倍數(shù)明顯較IPP組大（P＜0．05）。

3討論

γδT細胞是體內(nèi)固有免疫的重要T細胞群之一，它能迅速識別TCR信號和模式識別受體信號并做出應答，并有研究發(fā)現(xiàn)其具有適應性免疫和部分免疫記憶的特點，因而目前認為γδT細胞是固有免疫與適應性免疫的橋梁，其相關研究倍受關注［1］。γδT細胞能夠直接識別腫瘤應激抗原、磷酸化合物以及熱休克蛋白的同源分子，其中磷酸化合物具有特異性擴增活化γδT細胞的能力已經(jīng)得到反復證實［12－14］，如本研究所采用的Zol和IPP都屬于此類物質(zhì)。Zol的化學成分為氨已基咪唑類雙磷酸，為雙膦酸類藥物，具有抑制破骨細胞，抑制骨吸收之功效，臨床上被廣泛用于治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥和Paget＇s病，也被用于惡性腫瘤病人骨轉移和高鈣血癥的治療。近年的臨床研究表明，相對于其他患者，接受過Zol治療的腫瘤患者的生存率及腫瘤殺傷率都得到一定提升，其腫瘤患者體內(nèi)的γδT細胞的數(shù)量有較為明顯的上升［15－16］。目前已有研究者采用Zol代替IPP進行γδT細胞的體外擴增［11］。

為了進一步驗證唑來磷酸對γδT細胞的擴增效率，本文研究比較了Zol和IPP兩類磷酸抗原對前列腺癌患者外周血中γδT細胞的特異擴增能力，篩選確定其最佳的增殖條件，建立穩(wěn)定的體外特異性擴增前列腺癌患者外周血中γδT細胞方法，為日后γδT細胞的在腫瘤免疫治療應用中打下基礎。圖4Zol／IPP刺激前列腺癌患者外周血中γδT細胞增殖倍數(shù)Fig．4AmplificationfoldsofγδTcellsstimulatedbyZol／IPPonprostatecancerpatient本研究重點對Zol聯(lián)合rhIL－2刺激前列腺癌患者外周血中的γδT細胞培養(yǎng)法進行了研究，并與IPP聯(lián)合rhIL－2刺激培養(yǎng)法進行了比較，研究結果顯示，Zol和IPP均能在體外有效的擴增前列腺癌患者外周血中的γδT細胞，兩者對γδT細胞的趨勢是一致的，均在刺激的第11天達到其擴增高峰，且擴增培養(yǎng)至第9天的γδT細胞對腫瘤細胞都有一定的殺傷活性。但從整個培養(yǎng)體系來看，Zol作為磷酸抗原刺激γδT細胞時，其擴增效率以及擴增倍數(shù)都明顯較IPP好，且對腫瘤細胞的殺傷活性亦較IPP組強。綜上所述，不管是采用Zol還是IPP作磷酸抗原時，都能在體外有效擴增前列腺癌患者外周血中γδT細胞。但Zol相對于IPP來說價格低廉，毒性小，而且Zol作為一種注射液應用的用藥，比IPP更為安全的優(yōu)勢，故我們認為，在體外磷酸化合物Zol作為γδT細胞的擴增刺激劑，特別是對以γδT細胞為基礎的腫瘤免疫治療方面，其應用前景可能更為廣闊。

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作者：郭吉楠1，房杰群1，袁也晴1，楊江根1，鄒暢2，趙盼2，肖克峰1