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本文作者：楊志華1,2趙曼3哈小琴1,2作者單位：1.蘭州軍區蘭州總醫院檢驗科2.甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室3.蘭州大學第二臨床醫學院

肝細胞生長因子（hgf）又稱離散因子（SF），最初作為肝細胞有絲分裂原從肝部分切除大鼠的血液中分離，其活性不具種屬特異性并可刺激肝細胞合成DNA［1］。HGF具有廣泛的生物學效應，參與多種細胞的增殖、遷移和形態發生。同時研究發現，HGF是一種神經營養因子，對神經具有營養和保護作用，目前對HGF在基礎及臨床方面的研究皆已取得較大進展。

1HGF及其受體結構

HGF是可溶性細胞因子，屬于纖溶酶原依賴性的生長因子家族。HGF由間葉起源的細胞合成和分泌，組織細胞分泌的無活性單鏈前體蛋白在適宜條件下經胰蛋白酶樣蛋白水解酶作用，裂解為有活性的雜二聚體，由α鏈（69kD）和β鏈（34kD）通過一對二硫鍵相連而成。α鏈N末端有一發夾結構，其C末端有4個Kringle結構域，分別為K1、K2、K3及K4區。其中，發夾結構和K1區是HGF與受體c－Met結合的關鍵部位，而發夾結構和K2區一起構成HGF與肝素及硫酸乙酰肝素親和的必需結構；β鏈組成1個無功能的絲氨酸蛋白結構區，與HGF的促細胞運動作用有關。HGF受體是原癌基因c－Met編碼的一種跨膜蛋白，由50kD的α鏈和145kD的β鏈經二硫鍵相連成雜二聚體，具有Ⅱ型酪氨酸激酶受體的結構，含細胞外結合區、跨膜蛋白區、胞內蛋白激酶區。α鏈和β鏈N末端位于細胞表面，N末端胞外區有參與HGF結合的半胱氨酸富集區，C末端包括跨膜區、細胞質內區、酪氨酸激酶和自身磷酸化位點。HGF與細胞膜上受體結合后，受體構象發生變化，激活受體本身的酪氨酸蛋白激酶，引起系列級聯反應，使其發揮正常的生物學活性。

2HGF及其生物學活性

HGF可刺激細胞增殖，修復組織器官的損傷，發揮有絲分裂原的作用；促進胚胎的發育及各類組織器官的形態發生，發揮形態發生原的作用；促進細胞的遷移和侵襲，對某些組織的形成和發育及腫瘤的轉移、侵襲具有重要意義。最近研究發現，HGF對中樞系統神經元的生長、分化、修復和再生也起重要作用。

3HGF及其受體在中樞神經系統中的表達

在神經系統中HGF及其受體表達廣泛，在神經細胞和神經膠質細胞中都有合成和表達，在神經細胞中的表達比膠質細胞更強。在成年鼠大腦皮質，HGF在皮質Ⅳ、Ⅴ層的錐體細胞上表達，而c－Met則在皮質Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ層的神經元以及海馬、小腦顆粒細胞層、室管膜細胞、脈絡膜細胞、松果體、初級嗅皮質、扣帶回皮質和內嗅皮質、隔板、腦橋等部位表達。另外，HGF和c－Met在脊髓背根神經節、三叉神經中腦核等均有表達［2］。

4HGF在中樞神經發育中的營養作用

作為中樞神經系統的營養因子，HGF在發育中能夠促進中樞神經系統神經不同亞群神經軸突的存活和生長，促進胚胎干系細胞的分化，參與皮質神經元細胞的起源、分化、遷移及神經元生存過程中的發育和維持，促進海馬神經元成熟，促進少突神經膠質細胞軸突的生長和發育。Sun等［3］通過定量PCR檢測和免疫組化分析HGF及其受體c－Met在小鼠大腦皮質發育過程中的表達和功能，結果顯示HGF參與皮質神經元在分化、運動發生以及神經起源、神經元生存過程中的發育和維持。有報道HGF和c－Met通過Akt／GSK－3β途徑的活化可調節海馬神經元分化過程中樹突早期階段的成熟［4］。還有研究表明HGF通過調節突觸N－甲基－D－天冬氨酸（NMDA）受體支架蛋白的表達，促進幼海馬神經元興奮性突觸的成熟［5］。Nicoleau等［6］報道，內源性HGF在腦室下帶（SVZ）區神經干細胞的生長和自我更新中發揮著重要的作用。其通過免疫組化、ELISA等方法檢測表明培養的SVZ細胞產生并釋放HGF，HGF中和抗體能夠抑制SVZ細胞條件培養基中SVZ細胞的增殖。這表明內源性的HGF對SVZ細胞具有促有絲分裂作用。同時，腦部免疫組化證實HGF由表達巢蛋白的細胞產生，而c－Met則由SVZ區未成熟的細胞表達。腦內注射HGF可促進SVZ細胞的增殖，而腦內注射HGF中和抗體后SVZ細胞增殖減少。Ohya等［7］認為HGF對多種神經元具有神經營養作用，在大鼠出生后的第3天（P3）、第7天（P7）和第14天（P14）對大鼠紋狀體的c－Met／HGF受體或磷酸化的c－Met和NG2或RIPP7進行雙重免疫染色、westernblot分析、電子顯微鏡檢查，研究結果表明HGF增加少突神經膠質細胞祖細胞的增殖并減少其分化生成髓鞘少突神經膠質細胞，由此推測，HGF能促進少突神經膠質細胞軸突的生長。實時定量RT－PCR顯示，從P7到P14，紋狀體HGFmRNA表達下調，這可能有利于少突神經膠質細胞的祖細胞分化為生成髓鞘少突神經膠質細胞。由此表明c－Met信號和HGF的調節在少突神經膠質細胞的發育中發揮著重要的的作用，HGF促進大鼠出生后發育中少突神經膠質細胞的增殖，抑制它的分化。Lan等［8］證實外源HGF可誘導紋狀體多巴胺能神經前體細胞增殖和遷移，相應的抑制劑能抑制或阻斷外源HGF的這種作用，這為帕金森病的治療提供了新的途徑。

5HGF對腦損傷的保護作用

5．1HGF對體外培養的神經元的保護作用

HGF作為一種神經營養因子，能促進體外培養的皮質神經元、海馬神經元、星形膠質細胞等多種神經細胞的增殖，抑制其凋亡，增強其耐受能力，從而對神經元起到保護效應。黃韻等［9］通過研究腺病毒介導人肝細胞生長因子（Ad－HGF）對體外無血清培養所致大鼠皮質神經元損傷的保護作用，證實Ad－HGF對接種后2h轉染組無血清培養所致的神經元損傷有顯著的保護作用，對接種后第5天轉染的皮質神經元無血清所致的損傷雖亦具有一定的保護作用。Akita等［10］通過興奮性毒素NMDA誘導海馬神經元興奮性神經毒性作用，HGF處理能降低NMDA受體亞基NR2B的突觸定位，抑制興奮性中毒之后突觸前蛋白突觸蛋白Ⅰ下降。且HGF處理后，隨著興奮性毒素NMDA的增加NR2B亞基的水平下降趨勢減弱，在環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB）的磷酸化作用中，去極化反應的NMDA受體的活化受到抑制。由此表明HGF能夠降低NMDA受體亞基突觸的局部定位，阻止細胞內信號通過NMDA受體，防止神經元細胞的壞死，從而保護體外培養的海馬神經元細胞的存活。賀芳等［11］在研究HGF對缺氧、缺糖誘導的星形膠質細胞損傷及凋亡的影響時發現HGF能減少星形膠質細胞凋亡，并呈一定的劑量依賴關系，從而對缺氧缺糖引起的星形膠質細胞損傷具有保護作用。此外，He等［12］觀察HGF是否對培養的受到缺氧／再充氧大腦皮質神經元具有直接的保護作用，并對其作用的細胞內信號調節機制進行研究，結果發現HGF預處理能夠減少缺氧／再充氧所導致的大腦皮質神經元細胞生存減少和凋亡細胞數目的增多。HGF在皮質神經元中能夠刺激ERK1／2和Akt的活性。而ERK活性的抑制能夠完全消除HGF的保護作用，Akt活性的抑制能夠降低但是不能完全消除HGF介導的神經保護作用。由此提示，HGF的神經保護作用依賴于ERK1／2通路，而很少依賴于PI－3K／Akt通路。而且，HGF預處理能夠顯著降低缺氧／再充氧誘導的Bcl－2和Bcl－xL的表達，Bcl－2和Bcl－xL可能促進HGF的保護作用，但對Bax的表達沒有影響。Doeppner等［13］在研究HGF對下丘腦誘導的持續神經營養作用潛在機制的體外研究發現，HGF能夠促進下丘腦神經球形成和降低缺氧損傷中caspase－3的表達。Tnges等［14］應用重組的HGF作用于培養的視網膜神經節細胞細胞，發現其存活率明顯增加，其機制可能與c－Met的磷酸化以及之后的Akt和MAPK下游信號通路中有關神經存活因子的激活有關。此外，Nicoleau等［6］發現HGF促進SVZ細胞增殖并促進其形成神經球。總之，HGF不僅在中樞神經系統的發育中不可或缺，在中樞神經的損傷修復中也發揮著重要作用，尤其在腦缺血損傷中。

5．2HGF對腦缺血損傷的保護作用

腦缺血引起的不可逆損傷和神經變性性疾病，可能會導致進行性癡呆和大腦認知功能的衰退。因為腦缺血損傷的整個過程極為復雜，用內源性多功能因子治療防止腦缺血損傷的并發癥是個很好的選擇。作為多效應因子，在腦缺血損傷中，HGF能夠改善腦缺血、抑制凋亡通路的激活，保護神經細胞免受缺血損傷，同時能夠減輕局部缺血對血腦屏障的破壞。Trapp等［15］報道HGF表達于缺血再灌注的大腦和凋亡的神經細胞，而在壞死的神經細胞未見表達。楊燕等［16］在研究大鼠局灶性腦缺血后HGF表達的動態變化時發現腦缺血后可上調HGF在大腦的表達，提示HGF參與了缺血性腦損傷的病理發展及修復過程。Wakatsuki等［17］研究發現腦缺血誘導神經元HGF的表達，并在腦缺血再灌注后發揮神經保護作用，延遲海馬神經元的壞死，抑制導致抑郁和焦慮相關行為的增加，在海馬神經元的成熟和功能中發揮著重要的作用。Takeo等［18］通過向大鼠體內注射微球體使之形成栓塞，誘發腦部水腫，之后通過右腦室注射HGF進行治療，結果發現在微球體栓塞的大腦右半球組織水明顯增加，微球體栓塞誘導的組織中的鈉離子和鈣離子增加，而組織中的鉀離子和鎂離子降低。HGF的治療能抑制組織水中鈉離子和鈣離子的增加，但不能減少鉀離子和鎂離子的增加，提示HGF能抑制微球體栓塞引起的大鼠缺血性腦水腫的形成。Hu等［19］發現HGF具有對抗H2O2誘導的大鼠皮質神經元凋亡作用，其作用機制可能與HGF抑制凋亡的線粒體途徑，降低神經元caspase－3活性有關。Niimura等［20，21］發現在前腦局部缺血時，HGF主要通過抑制DNA的氧化損傷和阻止PARP／p53／AIF途徑的活化來抑制海馬神經細胞的壞死，從而發揮其保護中樞神經的作用。而HGF對海馬CA1區大腦局部缺血引發的細胞壞死的保護效應與神經元的APE／Ref－1表達量的提高和膠質樣細胞中還原型輔酶Ⅱ氧化活性的抑制有關。還有研究者用HGF治療小鼠急性腦缺血45min腦紋狀體損傷，通過對缺血的小鼠紋狀體持續4周的觀察，研究腦損傷和神經系統的恢復。發現接受HGF處理的小鼠在腦缺血24h后能夠保持血腦屏障的完整性，這與腦缺血4h和24h分別受到基質金屬蛋白酶（MMP）－2和MMP－9的抑制作用有關。而HGF誘導的持續神經營養作用的潛在機制可能是通過增加神經前體細胞神經元的分化來促進細胞的增殖和改善神經血管的重塑，從而長期保護神經［13］。Shang等［22］通過短暫的大腦中動脈栓塞之后立即再灌注建立大鼠腦缺血再灌注模型，并局部涂抹給予HGF進行治療，在大腦中動脈栓塞的第1、2天和第3天注射5－溴脫氧尿苷，2次／d，結果發現，第14天HGF顯著的降低腦梗死體積和TUNEL陽性細胞的數量，增加室下區5－溴脫氧尿苷陽性細胞的數量和缺血區5’－溴基－2’－脫氧尿苷陽性細胞分化成成熟的神經元。且在HGF處理組大鼠的缺血邊界觀察到血管發生和突觸發生增強，顯著降低神經膠質瘢痕的形成和大腦軟腦脊膜疤痕的厚度。由此證實HGF具有顯著的神經營養作用，促進神經發生、血管發生和突觸發生、抑制大腦中動脈栓塞之后的纖維變性。此外，Shang等［23］還研究了HGF在大鼠大腦中動脈閉塞后對梗死體積的影響、抗凋亡效應、抗自噬效應及其變化。研究者通過HE染色分析腦缺血梗死體積，TUNEL染色檢測抗凋亡作用，westenblot檢測LC3和磷酸化的mTOR／Ser（2448）（p－mTOR）評價腦組織的抗自嗜作用。結果顯示，HGF能夠顯著降低腦缺血后的梗死體積；大腦中動脈栓塞后LC3－I和LC3－II的數量明顯的增加，而HGF能夠顯著的降低LC3－I和LC3－II的表達量。HGF顯著的增加p－mTOR陽性細胞的數量，并顯著的降低TUNEL、LC3和LC3／TUNEL雙陽性細胞的數目。在LC3和TUNEL陽性細胞中大約有34．3％LC3／TUNEL雙陽性細胞。提示HGF的保護效應不僅與抗凋亡有關而且與抗自噬作用有關，可能2種細胞死亡的方式在同一個細胞和同一時間發生，HGF能夠改善細胞的這2種細胞死亡的方式。Takeuchi等［24］通過超聲介導的基因轉移方法將過表達的人HGF的DNA質粒轉移入具有認知功能障礙的小鼠模型中，結果表明，在小鼠的行為試驗中，其認知功能障礙得到明顯的改善。HGF可能通過以下途徑改善小鼠的認識功能障礙：①顯著恢復海馬齒狀回血管密度；②上調腦源性神經營養因子（BDNF）；③顯著降低氧化應激；④促進突觸的生長。Takeo等［18］通過微球體栓塞模型，檢測HGF在腦缺血誘導的學習和記憶功能障礙，神經細胞壞死和內皮細胞損傷中的作用。研究表明HGF治療能夠通過抑制凋亡誘導因子進入神經核來保護海馬神經元，對抗缺血誘導的細胞死亡，同時，HGF具有抑制腦栓塞后的組織降解，改善學習和記憶功能，其機制可能是通過防止大腦血管的損傷來發揮保護作用。綜上所述，HGF作為一種多效應因子，通過多種途徑發揮對大腦的保護，將來其可能成為治療并發的腦缺血損傷疾病的一種新的策略。

6HGF對脊髓損傷的保護作用

此外，HGF能夠促進損傷脊髓神經再生和突出重塑，促進損傷神經修復及血管生成，從而保護脊神經。余清平等［25］觀察HGF在大鼠脊髓和背根神經節的表達，發現脊髓和背根神經節內的HGF通過與受體c－Met結合可能在神經再生及突觸重塑性方面起一定作用。Zheng等［26］通過大鼠坐骨神經結扎模型，檢測HGF和c－Met在背根神經節和腰脊髓的時空表達。在坐骨神經結扎后1～14d，身體同側的L4－L5背根神經節HGF的表達顯著下降，而在第5天和第7天表達達到最低水平。相對的，HGF在腰部脊髓的表達沒有明顯的變化。在坐骨神經結扎后，c－Met在脊髓腹角的表達保持穩定。由此表明HGF／c－Met系統是被外周神經損傷誘導的一種獨特的信號通路進行時空調節的，這種信號通路能夠促進損傷神經的存活，尤其是成熟的背根神經節神經。然而，Pan等［27］報道外周神經的損失并不能誘導脊髓HGF表達量的增加，其在外周神經損傷后用，用克莫司誘導脊髓內源性HGF的高表達，從而保護神經并促進軸突的延伸。Kitamura等［28］在脊髓神經損傷后，給予攜帶有HGF的無毒性單純皰疹病毒，檢測是否能促進脊髓損傷的修復。發現在急性脊髓損傷中，HGF基因對傳輸受損的脊髓發揮多重有益效應，能夠顯著的促進脊髓損傷后神經元和少突膠質細胞的存活及血管發生，促進脊髓損傷的內源性修復，從而減少損傷的區域并促進軸突再生和功能恢復。

7HGF在中樞和外周神經系統疾病中應用的前景

目前國內外已經開展了HGF對肌萎縮側索硬化［29］、Alzheimer病［30］和缺血性腦血管病的臨床前研究。但內源性HGF的作用短暫而微弱，而且有效藥效濃度低，不足以完全修復各種較為嚴重的損傷。因此，有必要應用外源性HGF來促進損傷神經組織的修復。隨著研究的深入，研究者逐漸采用工程技術手段將HGF基因導入特定的載體內，使其安全高效地在機體內表達。目前用作HGF載體的主要有腺病毒、減毒沙門氏菌、日本血凝集病毒及大腸桿菌，且研究證實這些載體具有較好的安全性。但在臨床應用方面還存在一些問題：①HGF有促進腫瘤浸潤的作用，其用于不同神經損傷的最佳治療劑量和有效血藥濃度尚未確定，大劑量應用HGF是否會產生意想不到的不良反應？有無引起新腫瘤的潛在可能？②由于血腦屏障的存在，使得HGF很難通過全身循環到達中樞神經系統，目前HGF給藥方式主要是局部用藥，對中樞神經損傷的治療主要是通過蛛網膜下腔注射，風險較大，如何使HGF簡單、安全、高效通過血腦屏障，是臨床急需解決的難題之一；③HGF作為一種多效應因子在神經損傷治療中的深層機制尚不完全明確。HGF在應用中尤其是大劑量應用可能有許多副作用，故對其功能和機制需作進一步研究，并應利用基因工程對HGF進行改造，使其活性更穩定、作用更特異、藥效更持久、毒副作用更小。如何應用簡單、特異而有效的方法使HGF在神經性疾病的治療中達到臨床所期望的療效已經成為目前基礎及臨床研究工作的主要方向。