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流式細胞儀范文第1篇

【關鍵詞】 缺鐵性貧血；淋巴細胞免疫表型； 流式細胞儀；骨髓細胞學檢查

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.14.009

Investigation of flow cytometry in examination of lymphocyte immunophenotyping in iron-deficiency anemia patients YANG Hong， MENG Yan， WANG Chao. Department of Inspection， Beijing Fengtai Hospital， Beijing 100070， China

【Abstract】 Objective To research the changes of lymphocyte immunophenotyping in iron-deficiency anemia （IDA） patients. Methods There were 30 iron-deficiency anemia patients （IDA group） and 30 healthy people （normal control group）， and they all received flow cytometry three-color direct immunofluorescent method for detection of lymphocyte immunophenotyping. Comparison was made on the peripheral blood lymphocyte immunophenotyping between the two groups. Results IDA group had much lower levels of CD3+、CD3+CD4+， and CD4+/CD8+ ratio in peripheral blood than the normal control group （P<0.01）， and it also had higher CD3+ CD8+ value than the normal control group （P<0.05）. Conclusion Iron-deficiency anemia may affect proliferation and differentiation of T lymphocyte， resulting in decreased immune functions and immune regulatory dysfunction.

【Key words】 Iron-deficiency anemia； Lymphocyte immunophenotyping； Flow cytometry； Marrow cytology examination

缺鐵性貧血是因機體鐵的需要量增加和鐵吸收減少， 使體內儲存鐵耗盡而缺乏， 又未得到足夠的補充， 導致合成血紅蛋白的鐵不足而引起的貧血。是人類最常見的慢性疾病之一。淋巴細胞免疫表型是了解機體免疫系統功能的狀態。在正常機體內各淋巴細胞亞群的相互作用， 維護著機體正常的免疫功能， 當淋巴細胞亞群的數量和功能發生異常時， 都可導致機體免疫功能紊亂并發生一系列的病理變化。淋巴細胞免疫表型的分析對一些疾病的診斷、治療、免疫功能重建、器官移植監測等有重要的臨床意義。流式細胞儀檢測缺鐵性貧血與淋巴細胞免疫表型的關系， 國內外報道較少。現將本院2012年1月～2014年12月收治的30例IDA患者進行了外周血淋巴細胞免疫表型（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+/CD8+）的檢測， 并與正常人對照。現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 30例IDA患者作為IDA組， 男5例， 女25例， 年齡23～81歲， 中位年齡46.5歲。血紅蛋白48～92 g/L， 紅細胞（3.24～4.76）×1012/L， 網織紅細胞0.1%～1.0%， 外周血紅細胞呈小細胞低色素性改變。骨髓細胞學檢查示：骨髓增生明顯活躍-活躍， 粒/紅比值1.91～4.37， 紅系增生活躍， 以中晚幼紅細胞為主， 晚幼紅細胞核固縮明顯。成熟紅細胞大小不等， 以小者居多， 中心淡染區明顯擴大。骨髓細胞鐵染色：外鐵（-）， 細胞內鐵為0～13%， 骨髓報告：符合缺鐵性貧血骨髓象。血清鐵2.51～11.5 mol/L， 血清鐵蛋白3.15～12.4 ng/L。全部病例服用鐵劑治療有效。另選健康體檢者30例作為正常對照組， 其中男10例， 女20例， 為血常規、血清鐵、鐵蛋白各項指標均在正常范圍內， 且無其他器質性病變。兩組一般資料比較， 差異無統計學意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 儀器與試劑 采用美國BD FACSCalibur流式細胞儀， 三色標記McAb：CD3FITC/CD4PE/CD45PerCP、CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP、紅細胞裂解液、熒光校準微球 calibrate 3 Beads均購自美國BD公司。

1. 3 方法

1. 3. 1 樣品的制備 各管分別加入CD3FITC/CD4PE/CD45 PerCP、CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP熒光抗體20 μl， 再分別加入新鮮EDTA-K3抗凝外周血100 μl， 混勻， 室溫避光孵育 20 min， 加入 1∶9 配制的溶血素 2 ml， 避光 10 min。2000 r/min 離心5 min， 倒掉上清液， 加入 PBS 緩沖液 2 ml， 2000 r/min 離心5 min。去上清， 加入500 μl PBS混勻待測。

1. 3. 2 流式細胞儀測定 以熒光微球calibrite 3-colour校準儀器補償、使儀器分辨率CV<2%達到最佳工作狀態， 采用MultiSET 軟件獲取數據。建立SSC/CD45Percp、CD4PE/CD3 FITC、SSC/CD3FITC熒光點圖， 用CD45-PerCP/SSC-Gating和Back-Gating 細胞群雙圈門以排除碎片的干擾， 調節 FSC、SSC、Detectors/Amps、Copensation， FL1-FL 2% 、FL2-FL 1% 熒光補償， 每管獲取1.5萬個細胞， 建立CD4+/CD3+、CD8+/CD3+散點圖， Th（CD4+）和Ts（CD8+）的表達情況， 同時計算出 Th/Ts 比值。

1. 4 統計學方法 應用SPSS11.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

IDA組外周血中CD3+、CD3+CD4+及CD4+/CD8+比值顯著低于正常對照組（P<0.01）， CD3+CD8+值高于正常對照組（P<0.05）。見表1。

3 討論

3. 1 缺鐵性貧血是一種全球性疾病， 雖然隨著現代物質生活條件的改善， 各種營養缺乏性疾病已大為減少， 但缺鐵性貧血仍然是人們所面臨的威脅健康的一大難題。為了了解缺血性貧血對機體免疫系統功能的影響， 本試驗通過流式細胞儀三色免疫標記法觀察30例成人缺鐵性貧血外周血淋巴細胞免疫表型的變化， 總結出缺鐵性貧血主要影響機體的細胞免疫功能， 可引起細胞免疫功能障礙和免疫調節紊亂。

3. 2 淋巴細胞是免疫系統的重要組成部分， 在人體細胞免疫中發揮核心作用。T 細胞免疫主要通過T 細胞的增殖分化來實現， 這是一個消耗能量 、依賴核酸及蛋白質合成的復雜過程。CD3+ CD4+ T 細胞是輔/誘導性T淋巴細胞（Th細胞）， 也是遲發性超敏反應的啟動者、促使B細胞產生抗體的輔助細胞、抑制性T淋巴細胞的誘導細胞；CD3+CD8+ T 細胞是抑制性/細胞毒性T細胞（Ts細胞）， 是細胞毒性T 細胞介導反應的效應細胞， 也是抑制B細胞產生抗體的抑制性細胞； 當CD4+/CD8+比值發生變化時， 可引起機體免疫功能降低。從而影響淋巴細胞的增殖和分化， 使T淋巴細胞功能受損， 導致免疫功能低下和免疫調節紊亂。

3. 3 缺鐵性貧血可對多系統造成危害， 但對免疫功能的具體影響具有爭議。Salaman 等認為， IDA 可影響人體整個免疫系統， 使特異性和非特異性免疫功能均下降； 本研究從機體免疫功能角度出發， 分析IDA 對人體免疫功能的影響， 結果發現IDA 患者CD3+、CD3+CD4+T細胞比例減少、CD3+CD8+ T 細胞比例升高， 提示IDA影響T細胞的增殖分化， 導致細胞免疫功能障礙和免疫調節機制紊亂。

參考文獻

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 王臘梅， 周紅彬. 3～6歲缺鐵性貧血患兒免疫功能變化研究 . 西南軍醫， 2004， 6（4）：9-10.

 禮征南， 王亞男， 董敏， 等. T-淋巴細胞亞群在血液病中的診斷應用. 中國醫藥前沿， 2010， 5（4）：63-64.

流式細胞儀范文第2篇

[關鍵詞]秋海棠；愈傷組織；變異；DNA含量

離體保存是種質資源保存的一條重要途徑，具有節省人力、物力、財力以及避免自然災害和病蟲害等優點。但是在離體保存過程中常有遺傳變異的發生，因此需要對離體保存材料進行鑒定。目前的鑒定方法包括形態學標記、細胞學標記、分子標記等。

秋海棠屬植物的染色體很小，計數十分困難。而且某些種類的細胞質中含有許多小顆粒，與因縊縮而變得極小的染色體難以區分，觀察難度較大。本研究用流式細胞儀對3種培養多年的秋海棠進行了DNA含量分析，以期為進一步研究該屬植物離體培養的遺傳變異規律提供基礎。

1.材料與方法

1.1植物材料

供試材料為溫室中保存和以愈傷組織形式保存10年的的花葉秋海棠（β.cathayana）、掌葉秋海棠（β.hemsleyana）和假厚葉秋海棠（β.pseudodryadis）。培養基為1／2MS培養基，不加激素，每2個月繼代一次。實驗前隨機選取3種秋海棠屬植物的愈傷組織進行培養，直至幼嫩葉片長出。

1.2方法

選取葉片約1cm2，加入0.5ml的Otto　I　buffer和2μl／ml的β巰基乙醇，用手術刀將其切碎，室溫孵育30min后用200目尼龍網過濾得到懸浮液。采用同樣的方法獲得水稻懸浮液。往懸浮液中加入1ml的Otto　IIbuffer（50μg·L-1的碘化丙啶和50μg·L-1的RNase），200目尼龍網過濾后置于常溫黑暗條件下染色1h。

1.3分析方法

流式細胞儀系統為FACSAria（美國BD公司）。以水稻為內標，每個種測定5個樣品，每個樣品至少收集20，000個細胞，變異系數控制在8％以內。使用BDFACSDiva軟件分析數據。DNA含量差異顯著性分析采用SPSS13.0分析軟件。

2.結果與分析

結果表明，離體保存的三種秋海棠植物中，掌葉秋海棠的DNA含量發生了非整倍性變化，離體培養材料的DNA含量是保存在溫室中材料的1.5倍，其它兩種秋海棠無明顯變化（表1）。

3.討論

流式細胞術（Flow　Cytometry，FCM）是目前染色體倍性鑒別中一種快速、有效地方法，它可以直接或間接測定細胞的DNA含量。20世紀90年代國內開始就有學者將FCM運用到植物倍性分析中。

通過對3種秋海棠DNA含量的測定，我們發現，掌葉秋海棠的DNA含量發生了非整倍性變化，而其它兩種秋海棠屬植物的DNA含量沒有發生變化。這3種秋海棠植物于同時進行離體保存，保存的時間和條件均相同，但它們的DNA含量變化的情況并不相同，說明植物體本身是影響變異的重要因素。另外，掌葉秋海棠的DNA含量為非整倍性變化，其原因可能是愈傷組織在培養的過程中由于單個染色體的丟失或獲得、不分離和染色體滯后所致。張俊娥等認為，在愈傷組織中有DNA含量加倍的現象是否就一定是染色體數目發生變化，不能僅僅通過DNA含量分布曲線來下結論，還需對其進性細胞周期分析。因為細胞處在分裂間期的s期時DNA進行復制，DNA含量也要加倍。所以，對于掌葉秋海棠DNA含量發生非整倍性變化的原因還有待于進一步研究。

流式細胞儀范文第3篇

關鍵詞：自噬；凋亡；3-甲基腺嘌呤（3-MA）；順鉑（DDP）；骨肉瘤細胞

1實驗材料

1.1細胞來源 骨肉瘤MG63細胞購于中科院上海細胞庫。

1.2主要試劑 3-甲基腺嘌呤（3-MA）、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、單丹黃酰尸胺（MDC）購于美國Sigma公司。Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒購于上海碧云天公司。

1.3實驗儀器 流式細胞儀（美國BD公司）、酶標儀（美國Thermo公司）、倒置熒光顯微鏡（德國LEICA公司）、低溫高速旋轉離心機（美國Beckman公司）、細胞培養孔板（美國NEST公司）。

1.4試劑配制

1.4.1 MDC溶液 將1 mg MDC粉末溶于1 mL無菌水中，可獲得3 mmol/L的MDC溶液，取上述溶液100 μL加到6 mL無菌水中，獲得實驗用50 μmol/L的最終溶液，置于4℃冰箱避光保存備用。

1.4.2 DDP溶液 取1 mL濃度為5 mg/mL的DDP，用無菌水稀釋到250 mL，即獲得20 μg/mL的DDP用于實驗，4℃冰箱保存。

2實驗分組

該實驗分為4組：空白對照組（加入等量的培養液做對照）、3-MA組（僅添加濃度為12.5 μg/mL的3-MA）、DDP組（僅添加濃度為20 μg/mL的DDP）、3-MA+DDP組（12.5 μg/mL的3-MA和20 μg/mL DDP同時添加）。

3實驗方法

3.1細胞培養 骨肉瘤MG63細胞培養于提前配置好的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，其中含有100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素。在濕度飽和的情況下，培養于5%CO2、37°的培養箱中，隔天換一次培養液，3 d傳代1次，取適量對數生長期的細胞進行下一步實驗研究。

3.2 MTT比色法 外源性MTT在活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶作用下能夠還原成藍紫色結晶甲，且該結晶物質不溶于水，DMSO可使不溶于水的甲溶解，在490 nm波長處可以用酶標儀檢測光吸收值，在死亡細胞中不存在上述反應過程，檢測不到吸光度值，從而可以用來比較不同組之間細胞增殖率。取細胞數為1×108個/L，種植于96孔板中，分別在每孔添加等量的細胞懸液，細胞培養液培養10 h后根據實驗分組在3個組中加入相應的藥物，在恒溫（37℃）5%CO2的環境下培養24 h后，將每孔加入等量的MTT溶液作用4 h，然后PBS溶液洗1遍，再加入等量的DMSO溶液，搖擺15 min，然后在酶標儀上檢測不同組的吸光度值（A）。結合以下公式計算細胞增殖率：細胞增殖率（%）=（實驗組A/對照組A）×100%。

3.3 MDC染色法 單丹黃酰尸胺（MDC）被細胞吸收后蓄積于嗜酸性的細胞囊泡中，在熒光顯微鏡下可以看到藍綠色或黃綠色點狀結構出現在細胞核周圍，經常被用來檢測細胞自噬囊泡的存在。取處于對數生長期的骨肉瘤MG63細胞（細胞數為1×105個/mL）加入24孔細胞培養板中培養12 h待細胞貼壁后根據實驗分組加入相應濃度的藥物繼續培養24 h，24 h后加入MDC溶液（濃度為50 μmol/L）避光環境中培養1 h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，用PBS洗滌，然后用倒置熒光顯微鏡觀察自噬空泡差異；同樣方法，經相應藥物處理24 h后，MDC染色、4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，然后分別收集各組細胞（不能收集倒置熒光顯微鏡觀察過的細胞，以免影響細胞熒光強度），用流式細胞儀檢測不同組細胞熒光強度。

3.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 磷脂酰絲氨酸位于正常細胞膜的內側，但是在細胞凋亡的初期，磷脂酰絲氨酸從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，出現在細胞外環境中，也就是所謂的磷脂酰絲氨酸外翻。Annexin-V是一種分子量為35~36 KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸高親和力特異性結合。 Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒是用帶綠色熒光燈熒光探針FITC標記的Annexin，直接用流式細胞儀檢測磷脂酰絲氨酸外翻這一細胞凋亡的重要特征，可以使壞死細胞呈綠色熒光。而碘化丙啶（PI）可以將壞死細胞和凋亡晚期失去細胞膜完整性的細胞染成紅色。因正常細胞不被FITC和PI染色，所以二者結合可以較準確檢測細胞凋亡情況。將細胞數為1×105個/mL的骨肉瘤MG63細胞種植于6孔板中培養，待細胞貼壁后，結合試驗分組加入相應藥物干預24 h，然后分組收集、離心細胞，PBS洗滌，按照Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒說明進行操作，經流式細胞儀檢測細胞凋亡率，比較各組間差異。實驗重復3次。

3.5統計學分析 用均數±標準差（x±s）表示實驗結果，在SPSS 17.0統計軟件幫助下進行統計學分析，多組間差異用單因素方差分析進行比較，取P

4結果

4.1 MTT法檢測各組細胞增殖抑制率 MTT法檢測結果顯示：與對照組相比，單獨添加3-MA對細胞增殖沒有明顯影響；單獨添加DDP細胞增殖率為（47.6±3.1）%；與單獨添加DDP相比，同時添加3-MA和DDP組細胞增殖率為（27.1±2.8）%，增殖率下降，P

4.2 MDC染色檢測細胞自噬 MDC染色后在細胞核周圍出現黃綠色的自噬空泡，與單獨添加DDP組相比，3-MA和DDP同時添加組細胞自噬空泡較少。經倒置熒光顯微鏡拍片后顯示，見圖1。通過流式細胞儀檢測各組熒光強度差異，結果提示：對照組為（83.1±8.2）%，單獨添加3-MA組為（89.8±9.5）%，單獨添加DDP組為（183.1±14.8）%，3-MA和DDP同時添加組為（121.5±10.4）%。3-MA和DDP同時添加組與單獨添加DDP組相比，P

圖1 不同組MDC染色后自噬空泡的變化

4.3流式細胞術檢測細胞凋亡 經流式細胞儀檢測我們發現，單獨添加3-MA組細胞凋亡率為（2.5±0.4）%；單獨添加DDP組為（12.5±1.1）%，與對照組相比，P

圖2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

5討論

骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感性是決定治療效果的關鍵因素，據統計仍有10%~25%患者對化療反應較差，根本原因在于對化療藥物產生耐藥性[1-2]。另外，臨床上不合理、不規范的使用化療藥物也可引起腫瘤細胞對藥物產生耐藥性，將嚴重影響治療效果。近些年多數研究[3-4]認為骨肉瘤的耐藥性與多種腫瘤基因位點或傳導通路有關，如骨肉瘤的生長、發展或耐藥性與信號傳導子STAT3通路的激活存在一定的相關性；腫瘤細胞對甲氨蝶呤耐藥與異位轉染miR-140存在聯系等。由于新的化療方案的實施，外加新的化療輔助藥物的應用，能很大程度上控制骨肉瘤的發展，產生良好治療效果[5-6]。為了尋找更有效、更廣泛的腫瘤化療輔助藥物，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對腫瘤耐藥性的影響日益引起大家的關注[7-8]。

順鉑屬于細胞周期非特異性藥物，結構類似于雙功能烷化劑，在DNA復制過程中發揮抑制作用。在骨肉瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌等實體惡性腫瘤中應用較廣泛。自噬是細胞通過自身來消除細胞內部衰老或死亡細胞來維持內環境穩定的過程。3-甲基腺嘌呤可以通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶（ClassⅢPI3K），阻止自噬體與溶酶體形成自噬溶酶體，進而發揮抑制作用，是一種常見的自噬抑制劑，廣泛應用于自噬相關基礎研究[9]。MDC是特異性自噬體標記物，被MDC染色的細胞核周圍可見藍綠色或黃綠色點狀結構，常用來檢測細胞自噬囊泡[10]。

本研究結合臨床中順鉑在骨肉瘤化療中的應用，借助自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤來說明自噬在骨肉瘤化療過程中的作用。經MTT比色法檢測，我們發現3-MA+DDP組細胞增殖率明顯低于單獨添加DDP組，P

隨著人們對自噬與腫瘤發生、發展機制研究的深入，我們不難發現通過調控自噬可以克服腫瘤耐藥性，促進細胞凋亡，為臨床獲得良好的治療效果提供實驗依據，該研究也證實調控自噬在改進腫瘤治療方案中有更寬闊的研究前景。但是如今，自噬抑制劑不能在臨床上應用的主要原因主要有：①自噬在臨床上還沒有特異性的抑制劑，實驗中應用的藥物還不能直接應用于臨床。②在臨床上對自噬水平的檢測到目前為止還沒有一個客觀定量的方法，比如根據一個血液標本或者腫瘤組織就可以檢測到自噬水平。這兩點也正是我們下一步繼續努力研究的方向。

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流式細胞儀范文第4篇

【關鍵詞】   cd36 免疫表型 多參數流式細胞術

    cd36 expression in leukemia  cells checked with multiparameter flow cytometry and its significance

    tang huarong, wang fachun, jiang yunwei, fei xia, jiang qian1,   xu wenlin,

    lin jiang

    central laboratory, people hospital, jiangsu university, zhenjiang 212002, china; 1department of medical laboratory examination, jiangbing hospital, jiangsu university, zhenjiang 212002, china

    abstract    the aim of study was to investigate the expression of cd36 in leukemia cells and to explore its significance in diagnosis and differntial diagnosis for leukemia in patients. blood samples from 133 cases of  leukemias were analyzed by cd45/ssc double parameters and multicolor flow cytometry in order  to determine the cd36 and other leukocyte differentiation antigens. the results show that  the cd36 positive rate was 21.8% (29/133) in 133 cases of  leukemia, 41.9% (26/62) in 62 cases of  aml(acute myeloid leukemia),  and none of the 54 cases of  lymphocytic leukemia was positive for this antigen. the positive rate of cd36 in m4(8/10), m5(12/12) and m6(3/3) was significantly higher than that in m1(0/9), m2(3/12), m3(0/16) (all p<0.001). the percent of positive cells  of cd36 in m5a was significantly higher than in m5b(p=0.001). a significantly negative regression was found between cd36 and cd117 in aml(r=-0.751, p=0.005). and a significantly positive regression was found between cd36 and cd14 in m4 and m5b (r=0.870, p= 0.011).  in monocyte lineage involved leukemia (mlil), the positive rate of cd36( 92.6%, 25/27 ) was significantly higher than that of cd14 ( 48.1%, 13/27)（p=0.001）.   none of the 7 cases with m5a was positive for cd14, but 4 of 5 cases of m5b were positive. the positive rate of cd117 in m5a was significantly higher than that of in m5b（p=0.01）. the positive rate of cd34 in m5 was low (33.3%,4/12). it is concluded that the combination of  cd36 with lymphoid and myeloid antigens is helpful to the diagnosis and differential diagnosis of lymphoid, myeloid and mlil. the positive rate of cd36 is higher than that of cd14 in mlil.

    key words    leukemia; cd36 antigen; immunophenotyping; multiparameter  flow cytometry

    j exp hematol 2007; 15(1):29-34

    近年來的研究表明,流式細胞術( fcm) 檢測結果對于確定白血病的診斷與分型至關重要。以往采用橫向分析的方法對白血病進行免疫分型的報道較多,而對于某一個特定標志在白血病免疫學診斷中的作用報道較少。

    單核細胞相關性白血病(monocyte lineage involved leukemia, mlil)包括急性粒細胞單核細胞白血病(amlm4a、m4b、m4c、m4eo)、急性單核細胞白血病未分化型（amlm5a）、急性單核細胞白血病部分分化型（amlm5b）、以幼稚單核細胞增生作為白細胞成分的急性紅白血病（amlm6）、慢性髓細胞白血病急性單核細胞變（cmlmobc）、慢性粒細胞單核細胞白血病（cmml）等均存在單核細胞成分。目前國際上普遍采用cd14作為單核細胞的表面標志而應用于白血病的免疫學診斷，但cd14 的陽性表達率較低，這給白血病（尤中國實驗血液學雜志  j exp hematol 2007; 15(1)多參數流式細胞術觀察cd36在白血病細胞上的表達及其意義其是單核細胞相關性白血病）的免疫學診斷與鑒別帶來了一定的困難［1］。

    cd36為一種膜糖蛋白，在造血細胞上主要表達于單核細胞、巨核細胞、紅系前體細胞［2］。我們采用多種高質量標準單克隆抗體和cd45/ssc設門多參數fcm對133例各類白血病患者白血病細胞中cd36的表達情況作了深入的分析,重點分析其在單核細胞相關性白血病上的表達情況，并分析了它與其它白血病細胞相關抗原如cd117、hladr、cd34等的相互關系, 結果報道如下。

    材料和方法

    對象

    2003 年10月-2005 年12 月來本院就診以及外院送本院作細胞表面標記檢查的白血病患者共133例,其中男性71例,女性62例,均為初診病例。患者年齡1.5歲-86歲,中位年齡44歲。急性白血病95例, 按fab 標準［3］診斷為急性淋巴細胞白血病(all)32例;急性髓細胞白血病(aml )62例,其中m1 9例,m2 12例,m3 16 例,m4 10例,m5a 7例, m5b 5例,m6 3例；參照1994 年歐洲白血病免疫分型研究組( egil)關于急性混合細胞白血病(acute mixed lineage leukemia,  amll) 診斷積分標準［4］, 診斷為amll 1例。慢性白血病38例, 其中慢性淋巴細胞白血病(cll) 22例,慢性髓細胞白血病(cml) 15例,慢性期13例及單核細胞白血病急性變2例，慢性粒細胞單核細胞白血病（cmml）1例。       

    樣本制備

    每管加入肝素抗凝的骨髓100 μl（細胞數1×105-1×106）及3種直接標記的熒光抗體各5-10 μl, 20℃反應20分鐘,再加入2 ml細胞溶解液(becton dickinson產品) ,振蕩后于室溫下置10 分鐘,用pbsbsa 洗滌細胞1 次,加入0.5 ml   pbs，待測 。

    試劑 

    所用標準單克隆抗體包括fitc、pe、percp 標記的cd10、cd19、cd20、cd22、cd2、cd3、cd5、cd7、cd56、cd11b、cd41a 、cd61、cd117、cd38、cd45、hla  dr、mpo（髓過氧化物酶） 單克隆抗體均購自美國becton  dickinson 公司，cd13、cd14、cd33、cd34、cd36單克隆抗體購自美國coulter公司。

    流式細胞術分析

    fcm 檢測用facscaliburtm流式細胞儀(becton  dickinson產品) 和cell quest 軟件獲取并分析10 000個細胞。通過cd45/ssc 設門識別幼稚細胞群, 再分析計算該幼稚細胞群各白血病相關抗原的陽性百分數。以白血病細胞表面抗原陽性百分數≥20%為抗原陽性病例。

    統計學處理

    用spss 10.0軟件包進行統計學處理,作相關分析、χ2 檢驗或fisher確切概率法，以p<0.05表示有顯著差異。

    結    果

    cd36在白血病細胞中的表達

    圖1為一正常骨髓cd45/ ssc散點圖。根據各群細胞cd45熒光強度與側向角反射（ssc）的差異可將骨髓細胞分為淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、

    figure 1.  dot plot of cd45-side scatter (ssc) of normal bm cells. r1 is blast cells ; r2 is nucleated erythrocytes; r3 is granulocytes; r4 is monocytes; r5 was lymphocytes.

    有核紅細胞和原始細胞群，對不同的細胞群體框定（即射門）后，即可知各群細胞所占的比例，并可明確顯示幼稚細胞群體的免疫表型（圖2）。

    figure 2. dot plot of cd45-side scatter (ssc) of leukemia bm cells. r1 is blast cells ;  r2 is nucleated erythrocytes; r3 is granulocytes; r4 is lymphocytes.

    133例病人中cd36陽性29例（陽性率21.8%），62例aml患者中表達cd36者26例，陽性率為41.9%。但54例淋系白血病中（其中all 32例， cll 22例）未見cd36陽性病例。15例cml中慢性期13例未見cd36陽性表達，另外2例cml單核細胞白血病急性變的患者cd36陽性，1例患者的免疫表型為： cd34+、cd38+，cd10+，cd13+、hladr+、cd36+、cmpo+/-；另1例患者的免疫表型： cd38+，hladr+，cd14+， cd36+、cd13+，cd33+，cd11b+。1例amll患者cd36表達為陰性。1例慢性粒細胞單核細胞白血病（cmml）cd36表達陽性，該患者表型為：cd13+、cd33+、cd14+、cd10+、hladr+、cd36+、cd11b+（表1）。

  在aml 各亞型中的表達

    在62例aml中cd36在m1 、m2 、m3、m4、m5a 、m5b 、m6中陽性率分別為0.0% (0/ 9) 、25.0% (3/ 12) 、0.0% (0/ 16) 、80%(8/10) 、100.0 %(7/ 7) 、100.0%(5/5) 、100.0%(3/3)。可見cd36陽性表達主要見于m4、m5、m6, 其陽性率明顯高于m1、m2、m3，差異具有顯著性（χ2=25.593, p<0.001； χ2=17.422, p<0.001； χ2=33.529, p<0.001）。在m4中，2例m4eo的患者全部為陰性，陽性細胞百分率分別為7.1%和8.6%。余8例m4a/b/c均為陽性，陽性細胞百分率20.5%-89.2%，中位數為28.4%。9例m5患者中cd36表達均為陽性，陽性細胞百分數25.3%-95.2%，中位數為50.8%。但在m5b組的陽性細胞百分數（50.8%-95.2%，中位數為89.6%）明顯高于m5a組（25.3%-36.5%，中位數為32.7%），差異具有統計學意義（f=15.273,p=0.001）。3例m6中2例為急性紅白血病，1例為急性紅血病。在2例急性紅白血病的骨髓細胞群體中有兩個異常細胞群體，一個群體為幼稚紅系群體，另一個群體為幼稚粒細胞單核細胞群體。在幼稚粒單核細胞群體中2例均為cd36陽性表達，陽性細胞百分數為40.0%和73.4%。1例急性紅血病的骨髓細胞中只有1個異常群體即幼稚紅細胞群體。在3例患者的幼稚紅細胞系群體中的cd36陽性細胞百分數33.60%-77.8%，中位數為73.2%。 這例急性紅血病患者的免疫表型為：cd33+、hladr+、cd36+、cd235a+、cd117+、cd71+、cd38+。在m1、m2、m3中只有3例m2a患者cd36表達陽性，其陽性細胞數百分數分別為22.1%-27.4%，中位數為24.3%（表2）。

    在aml組中，cd36表達的陽性細胞百分數與cd117表達的陽性細胞百分數呈負相關(r=-0.751, p=0.005)。在12例m2中2例為cd36+cd117+,1例cd36+cd117-， 8例cd36cd117+，1例cd36-cd117-; m4組7例cd36+cd117+，1例cd36+cd117-，2例cd36-cd117+。7例m5a全為cd36+cd117+，5例m5b中1例為cd36+cd117+，4例為cd36+cd117-。在m6 3例患者中全為cd36+cd117+（圖3）。在aml組中，cd36的陽性表達與hladr的陽性表達不相關（r=0.142, p=0.677）.在12例m2中3例cd36+hladr+，4例cd36-hladr+，5例cd36-hladr-。10例m4中6例cd36+hladr+，2例cd36+hladr-，1例cd36-hladr+，1例cd36-hladr- 。在7例m5a組中4例cd36+ hladr+, 3例cd36+hladr-。在5例m5b組中4例cd36+hladr+，1例cd36+hladr-。在m6均為3例患者均為cd36+hladr+。另外，在aml組中cd36的陽性表達與cd34的陽性表達不相關（r=-0.472, p=0.076）。在12例m2中3例cd36+cd34+，0例cd36+cd34-，6例cd36-cd34+，3例cd36-cd34-。10例m4中5例cd36+cd34+，3例cd36+cd34-，1例cd36-cd34+，1例cd36-cd34- 。在7例m5a組中3例cd36+ cd34+, 4例cd36+cd34-。在5例m5b組中1例cd36+cd34+，4例cd36+cd34-。在m6中1例為cd36+cd34+，2例為cd36+cd34-。在m4與m5b組別中cd36與cd14表達的陽性細胞百分數呈正相關(r=0.870, p=0.011)。在12例m2中3例cd36+cd14-，9例cd36-cd14-； 

     cd36陽性白血病其它髓系主要相關抗原的表達

    cd14在cmml、cmlmobc、m2、 m4、m5a、m5b、m6中陽性表達率分別為100.0%（1/1）、50.0%（1/2）、0.0%（0/12）、60.0%（6/10）、0.0%（0/7）、100.0%（5/5）、0.0%（0/3）。cd117在cmml、cmlmobc、m2、 m4、m5a、m5b、m6中陽性率分別為0.0%（0/1）、0.0%（0/2）、83.3（10/12）、90.0%(9/10)、100.0%(7/7)、20.0%(1/5)、100.0%（3/3）。cd117在m5a中陽性率明顯高于m5b（χ2=8.400, p=0.010）。cd34在其分別在cmml、cmlmobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的陽性表達率為0.0%（0/1）、50.0%（1/2）、75% (9/12)、60.0%(6/10)、42.9%(3/7)、20.0%(1/5)、33.3%（1/3）。cd34在m5的陽性率較低，為33.3%（4/12）。hladr分別在cmml、cmlmobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的陽性表達分別為100%（1/1）、100%（2/2）、66.7% (8/12)、70.0%(7/10)、57.1%(4/7)、80.0%(4/5)、100%（3/3）。cd13分別在cmml、cmlmobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的陽性表達率分別為100%（1/1）、100.0%（2/2）、100%(12/12)、90.0%(9/10)、85.70%(6/7)、60.0%(3/5)、66.7%（2/3）。cd33分別在cmml、cmlmobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的陽性表達率分別為100%（1/1）、50.0%（1/2）、91.7%(11/12)、80.0%(8/10)、58.7%(6/7)、100.0%(5/5)、66.7%（2/3）（表3）。

     討    論

    cd45 抗原表達于所有白細胞表面,雖然cd45 抗原存在3 個異構體,不同異構體在造血干/ 祖細胞及t 細胞表面表達不同,但本研究所用的cd45 抗體為識別3種異構體的共同抗體。cd45 在淋巴細胞、單核細胞、粒細胞及幼稚細胞的表達量不同,表現為cd45熒光強度不同。淋巴細胞最強,單核細胞次之,粒細胞比單核細胞弱,幼稚細胞比成熟細胞弱。結合細胞的ssc 值(反映細胞的顆粒性) ,可將骨髓細胞分為淋巴細胞,單核細胞,粒細胞及幼稚細胞群。cd45/ ssc 設門法的突出特點在于它可將異常的幼稚細胞與正常的成熟細胞區分開,因而能夠做到特異地對幼稚細胞進行分析［5］。我們在采用cd45/ssc雙參數射門的基礎上應用一系列高質量標準單克隆抗體對較大樣本白血病細胞cd36 的表達作了較為詳細的分析。結果發現，在133例白血病患者中aml組有41.9%（26/62）的患者cd36表達陽性，在54例淋巴細胞白血病中無1例cd36陽性表達。cd36是一種細胞膜糖蛋白，在造血細胞中它主要表達于單核細胞、紅細胞前體、血小板、巨核細胞上。本研究中12例伴有單核細胞分化的amlm4和amlm5亞型的病人中cd36表達全部為陽性，cml單核細胞白血病急性變2例及cmml 1例為cd36陽性，12例amlm2亞型組有3例cd36表達陽性。另外2例以單核細胞增生的amlm6 cd36表達全部陽性。作為單核細胞分化的抗原之一，其敏感性為92.6%（25/27）。雖然cd14 是單核細胞的特異性標志,但cd14 只有在成熟的單核細胞表達為陽性,幼稚單核細胞cd14表達為陰性。而多數m4/ m5 患者為幼稚單核細胞增多。因此免疫分型難以根據單項cd14 是否陽性而診斷m4/ m5。在本研究中cd14在單核細胞相關性白血病上的陽性率僅為48.1%（13/27），低于cd36的陽性率（92.6%，25/27）。cd14在m5a上陽性率為0.0%(0/7)，在m5b中陽性率為100%（5/5）。因此，在診斷單核細胞相關性白血病中結合cd36與其它單核細胞分化抗原(如cd14、cd64等)分析，有利于提高其診斷率。在amlm2組中有3例患者的cd36表達陽性，其原因可能與白血病細胞群體中混有部分單核細胞成分有關。cd36除了表達在單核細胞外，還在巨核細胞和早期紅細胞上有表達。在本研究中3例m6患者，在幼稚紅系群體上都有cd36的高表達，但他們同時都有glya和cd71的表達。因此同時加做cd41和（或）cd61（巨核系標志）、glya和/或cd71（紅系標志）及單核系其它標志抗原，可以將巨核細胞、早期紅細胞及單核細胞區分開來。這也同時說明，在白血病的診斷分型中須綜合多參數信息來分析。

    在單核細胞上cd36隨細胞的分化成熟而表達增加。在m4與m5b組中cd36與cd14的表達呈正相關。急性單核細胞白血病m5b的白血病細胞與m5a相比，前者在分化程度上較后者要成熟些，盡管本研究結果中顯示cd36在m5中都為陽性表達，但其在m5b上的表達的陽性細胞百分數明顯高于m5a，因此將cd36和cd14結合分析有助于m5的診斷及分型。m4為粒細胞和單核細胞成份同時存在，m4eo除了具有前面的特征外，嗜酸性粒細胞比例增多大于5%-30%。在本研究結果中顯示2例m4eo均為cd36表達陰性，他們的cd14表達也為陰性。其余的6例m4患者cd36表達均為陽性。cd36是否有助區分m4的亞型還需要更多的病例數來分析。cd14在m4患者中陽性率為60.0%（6/10），這與馮國安等［6］和寧鉑濤等［7］報道的較為相似。在aml組中cd36的表達與cd117呈負相關，m5a中cd117陽性率為100%（7/7），陽性細胞百分數為28.6%-92.5%，中位數為53.9%；cd36的陽性為100%（7/7），但其陽性細胞百分數為21.3%-36.5%，中位數為32.7%；m5b中cd117陽性率為20%（1/5），陽性細胞百分數為21.0%，而cd36的陽性率為100%，陽性細胞數為50.8%-95.2%，中位數為89.6%。cascavilla等［8］檢測了9例m5a患者，其白血病細胞都表達cd117，而在11例m5b中僅有1例表達該抗原。由此可見cd117主要在較幼稚的單核細胞上高表達，而cd36隨著單核細胞的成熟而表達增高。因此，結合cd117的表達情況也有助于區分亞型并可了解單核細胞的分化程度。另外，在aml組中cd36與hladr、cd34的陽性表達不相關。cd34在m5患者中多數（66.7%，8/12）為陰性表達，這與weir［9］和劉艷榮等［10］報道相似。

    綜上所述，本組資料說明：cd36陽性者可以排除淋系白血病（amll除外）；cd36作為單核細胞系分化的指標之一，其敏感性（92.6%，25/27）高于cd14（48.1%，13/27），但cd36還表達于紅系前體細胞、巨核細胞上，因此須結合cd36與其它單核細胞分化抗原分析才有助于提高單核相關性白血病的診斷率；另外cd36結合cd14和（或）cd117有助于區分m5亞型及了解單核細胞分化程度。

【參考文獻】

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4張之南. 血液病. 北京：人民衛生出版社，2003: 873-873

5li w, chen z, liu z, et al. application of cd45/ssc gating multiparameter flow cytometry in the classification of acute leukemia —— an analysis of 139 cases. j tongji med univ, 2001; 21:209-211

6馮國安，郭農建，黃平等. 單核細胞相關性白血病fcm免疫表型分析. 白血病·淋巴瘤， 2005；14：148-150

7寧鉑濤, 湯永民, 沈紅強等. 多參數流式細胞術觀察251例白血病細胞cd14表達的意義. 實用腫瘤學雜志，2003；18：101-105

8cascavilla n, musto p, d'arena g, et ai. cd117 (ckit) is a restricted antigen of acute myeloid leukemia and characterizes early differentiative levels of m5 fab subtype. haematologica, 1998, 83 : 392-397

流式細胞儀范文第5篇

【關鍵詞】流式細胞術，血小板，特發性血小板減少性紫癜，IgG，陽性

有研究發現血小板相關抗體的檢測在ITP的診斷和治療中有重要價值，但是傳統的檢測方法會增加患者的不適和痛苦、不利于患者的治療、采血量較多、家屬和患者難以接受等，更重要的是傳統方法是導致醫療糾紛的主要原因【1】。所以，尋找新的檢測方法，提高ITP患者的血小板相關抗體檢出率，對ITP患者的康復和減少醫療糾紛有重要作用。流式細胞儀對血小板相關抗體的檢測具有簡單、重復性高、結果準確、采血量少等優點，隨著對其研究的深入，發現流式細胞儀對臨床治療ITP的療效判定有一定的意義【2】，在臨床檢測當中，應用的范圍越來越廣。本文就流式細胞儀在檢測ITP患者血小板相關抗體中的意義作進一步探討，其探討結果如下：

1一般資料和方法

1.1一般資料 選取在2010年5月到2013年5月，來我院接受治療的100名特發性血小板減少性紫癜患者，隨機分成兩組，對照組和觀察組，每組各50人。觀察組患者中男28人，女22人，年齡在21到60歲之間，平均年齡為41.3歲；對照組患者中男29人，女21人，年齡在23到59歲之間，平均年齡為38.9歲。所有患者經詳細詢問病史、系統的體格檢查和實驗室檢查后確診為特發性血小板減少性紫癜。兩組患者在性別、年齡、病程及病情等一般資料上的差異沒有統計學意義即p>0.05。

1.2方法 首先進行采血及血漿分離，經肘靜脈采血后，加入EDTA-Na?2抗凝，然后離心10min，離心速度為1000轉每分鐘，用TEN洗滌分離出上層血漿，再對余血離心10min，離心速度為2500轉每分鐘，去上清，重復操作3次，分離出血漿；然后對以上標本進行檢測，對照組患者采用ELISA檢測，將洗滌后血小板的濃度調整為100×109/L，加入Triton懸液，4℃下破碎離心，用人IgG包被，封閉后加入人IgG標準液或者血小板破碎液，再加入羊抗人IgG稀釋液，培育后顯色，測定OD490吸光度值。觀察組患者采用流式細胞儀檢測IgG，首先將血小板進行標記，將羊抗鼠抗體或者羊抗人抗體與血小板懸液混合，洗滌兩次，孵育25分鐘后，進行檢測，然后進行流式分析，調整激光器的波長為488nm，調整儀器處于正常狀態，采用熒光強度道數對血小板表面的IgG含量進行測定。

統計學分析，采用SPSS13.0統計學軟件對檢測結果進行分析，分析結果如下：

2結果

對經流式細胞儀和ELISA法檢測特發性血小板減少性紫癜患者的IgG結果進行比較，其結果如下：

表1經流式細胞儀和ELISA檢測兩組患者的IgG結果比較

分組 人數 IgG平均含量 陽性人數 陽性率

觀察組 50 191±78b 43 86%

對照組 50 28±21 36 72%

從以上結果可以看出，觀察組患者的IgG陽性率明顯高于對照組患者，兩組患者在IgG陽性率上的差異有統計學意義即，P

對觀察組患者經激素治療后，經流式細胞儀檢測其治療前后的IgG平均熒光強度結果如下：

表2經激素治療前后的IgG平均熒光強度比較

患者 熒光強度

治療前 治療后

1到10名 81.32 49.20

11到20名 121.15 51.38

21到30名 69.39 31.41

31到40名 92.13 44.30

41到50名 86.36 50.12

從以上結果可以看出，流式細胞儀檢測ITP患者的IgG靈敏度較高，對患者的治療效果有一定的評估作用。

3討論：

診斷血小板相關疾病的關鍵是，檢測出血小板生存時間和血小板相關抗體【3】，流式細胞儀在判定血小板功能、對出血性疾病的診斷、診斷血栓性疾病和檢測血小板相關抗體等方面上有一定的優勢。傳統方法在檢測血小板相關抗體上有采血量較多、影響患者的治療效果、易引起患者的不適和痛苦、不能指導治療、可引起多種醫療糾紛等缺點【4】，因此，采用流式細胞儀進行血小板相關抗體的檢測方法逐漸在臨床檢驗上發展起來。本研究通過分別采用流式細胞儀和傳統方法對兩組患者進行血小板相關抗體的檢測，對檢測出的IgG陽性率進行比較，可以看出經流式細胞儀檢測的患者IgG陽性率明顯高于經傳統方法檢測的患者IgG陽性率；對觀察組患者進行激素治療后，經流式細胞儀檢測其IgG的熒光強度，靈敏度較高，可在一定程度上評估治療效果，對臨床治療血小板相關疾病有重要價值。

參考文獻：

[1] 余暉，高曉陽. 全血法流式細胞術檢測血小板相關抗體[J].細胞與分子免疫學雜志，2010，（12）：1296-1297.

[2] 聶詠梅. 流式細胞術檢測小鼠全血中人血小板方法的建立[J].廣東醫學，2010，31（16）：2049-2052.